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    农林牧渔-兽医学:非洲猪瘟的实验室诊断技术

    作者:猪业资讯
    发表于:2019-09-19
    阅读:2539
    评论:0

     

    本着接地气的原则,笔者尝试着对非洲猪瘟的实验室诊断技术,主要是荧光定量PCR技术和酶联免疫吸附技术,展开分析讨论,供ASF防控参与者一同交流。商品化试剂盒常常做为技术的载体出现,这里不做任何厂家试剂盒的广告,仅从技术角度分析讨论。在讨论诊断技术之前,笔者提出ASF商品化试剂盒的选择原则。

    1、试剂盒选择原则

     

    01、敏感性比特异性更重要

     

    去年8月3日沈阳非洲猪瘟疫情确诊之前,我国并不是ASF疫区,根除非洲猪瘟病毒的过程中,诊断技术敏感性与特异性不能兼顾的情况下,敏感性比特异性显得更加重要。用ELISA方法检测ASFV抗体时,间接ELISA较阻断ELISA的敏感性有优势。OIE官方建立的方法,也是间接ELISA(OIE Terrestrial Manual 2012; Chapter 2.8.1)。有条件的话,可以采用间接ELISA筛选,阻断ELISA复核。

     

    2、假阴性比假阳性危害更大

    得到非洲猪瘟的实验室检测结果后,阳性结果必然一下子戳中神经,震撼不已,对于阳性结果必然会进行复核。倘若是假阳性,便是虚惊一场。反而阴性结果常常直接略过,不被重视,若此结果是假阴性,那后果将是灾难性的。


    真实阳性

    真实阴性

    检测阳性

    √√√

    ×

    检测阴性

    ×××

     

    3、经过验证的商品化试剂盒才可信

    qPCR和ELISA是非常成熟的技术,商品化试剂盒的方法建立难度不大,而用大量临床样品、田间样品和标准品对商品化试剂盒验证与质控的过程,能够体现出严谨的科学态度。国内首发非洲猪瘟疫情之前并非疫区,无法收集到阳性样品,自主研发的商品化试剂盒的验证存在现实困难。不过日前农业部公布的两批非瘟试剂盒应该经过了验证,实验室可以放心使用。重磅!肇庆大华农通过第二次非洲猪瘟现场快速检测试剂评价

    2、荧光定量PCR

    笔者认为选择经OIE参考室验证的商品化试剂盒用于ASF监测排查,尽快掌握国内ASF疫情,快速处置,对ASF根除是有利的。部分商品化试剂盒在欧非等传统ASF疫区普遍使用,产品成熟而可靠。

    若采取统一“度量衡”,以便于全国检测结果数据的横向比对。采用OIE推荐的非洲猪瘟病毒扩增p72基因分型的通用型引物(p72-D/p72-U),开展监测排查具有现实可行性。导致检测结果出现假阳性和假阴性结果的因素很多,假阳性的原因自查后会发现,而如何避免假阴性结果的出现,是在检测工作开始之前需要认真考虑的事情。qPCR检测结果的价值取决于所用试剂的质量,除了引物以外,还需要提取试剂、预混液、对照试剂等。

    笔者在这里提出几点建议: 

     

    1、提供有效的检测样品是前提

     

    《非洲猪瘟现场排查手册》对样品的采集、包装与运输做出了详细说明,推荐使用“三重包装系统”,运送的样品必须附有做够的冷却材料(如冰袋),以防变质。确保送达实验室的待测样品是有效的,是开展检测工作的前提。实际基层采样工作中,低温保存和运输是存在现实困难的。在这一方面OIE参考实验室德国FLI实验室(Friedrich-Loeffler-Institute)做了很好的尝试,采用GenoTube拭子采样管做为采样工具,常温运输和保存送达实验室,开展qPCR核酸检测,ELISA和胶体金检测卡抗体检测。更欣喜的是FLI对非洲猪瘟的样品采集进行了验证。

     

     

     

    2、建立更严谨而合理的检测体系 设立内部阳性对照(IPC) 有效预防假阴性结果出现

     

     国内兽医实验室qPCR检测中会设立阴性对照和外部阳性对照,但却很少设立内部阳性对照(IPC)。Xeno IPC其实就是与所有物种基因组无交叉的核酸序列,被检测样品结果阴性,Xeno IPC检测结果阳性(Ct值预期范围是已知),有效证明无qPCR抑制剂存在,从而降低了假阴性结果的风险,对ASF这类重大动物疫病监测具有重要的意义。美国兽医实验诊断协会(AAVLD)在实验室指南中明确推荐Xeno IPC在qPCR检测过程中使用。

      

    3、选择高品质的核酸提取试剂和预混液

     

    PCR检测结果的价值取决于所用试剂的质量。核酸提取试剂盒必须是通用型样品制备试剂盒,可满足实验室对多种样品类型检测需求,并对全血、脾脏、淋巴结、扁桃体和环境样品等进行过验证。模块化技术经过专门优化,能够从最广泛的样品类型之中纯化核酸,具有高简便性、性能一致性并节省时间和成本,从而帮助提高实验室的效率。预混液要求对酶进行优化,以帮助鉴定那些最重要的动物病原体靶标,严格开发的试剂稳定且一致,即使用于最具挑战性的动物样品,在PCR抑制剂存在的条件下也依然有效。简单易用的预混液都能帮助获得值得信赖的结果。 

     

    4、环境样品的检测结果反应生物安全防护措施是否得当

     

    做好生物安全防护措施才能有效预防非洲猪瘟的传入已成为共识,问题来了,如何证明生物安全防护措施是否得当?构建完善的生物安全监控网络,有计划的采集动物体和环境样品进行qPCR检测,通过客观数据足以量化生物安全措施的防护程度。尤其是针对猪场交叉区域的出猪台、卖猪车、无害化处理车、员工澡堂地面等区域环境样品的检测。

     

    3、ELISA检测技术

     

    在《我国首例非洲猪瘟的确诊》(王清华等)中指出,在非洲猪瘟确诊的辽宁省沈阳市沈北区采集的2头病死猪及同群30 头临床健康猪血清,“对32 份血清样品的ASFV 特异性抗体检测结果均为阴性。” 通常感染了强毒力ASFV的猪只不产生抗体,感染了低致病力或非致死性毒株的猪产生高水平的抗体。急性或最急性死亡,病死率几乎100%是目前我国流行的非洲猪瘟疫情的显著特点,感染猪只未产生ASFV抗体已经死亡,因此很多人认为在当前疫情的情况下,开展血清学抗体检测是无意义的,在此笔者尝试着推敲当前疫情下ASFV抗体检测意义。

      

    笔者认为ELISA抗体检测存在以下意义:

     

    1、急性死亡的病例中也可以检出抗体

     

    《OIE陆生动物诊断试验和疫苗手册》强调:“在呈地方性流行或由低毒力毒株引起的初次爆发的地方,对于新暴发病的调查研究应包括应用ELISA检测血清或组织提取物中的特异性抗体;血清学方法在辅助确定ASF暴发时的作用不可低估,因为在急性死亡的病例中也可以检出抗体。

      

    2、及时发现新传入毒株或弱毒株 全面揭示ASF疫情状况

      

    我国首例确诊非洲猪瘟病毒株为格鲁吉亚毒株(Georgia 2007),病死率100%,应该属于强毒力毒株。但同时该毒株从东欧传入俄罗斯,又传入远东地区传入中国,相比较而已,弱毒力毒株具有一定的隐蔽性,更有利于其长距离的传播。从这一点上来看,传入我国的ASFV格鲁吉亚毒株可能也具备一定的隐蔽性。另外,已经明确了23种基因型(Boshoof等,2007),报道的来自不同区域的毒株超过58株。其他基因型或毒株并不会静候在国门之外,强弱毒株都有出入的风险存在。

      

    3、及时发现非洲猪瘟病毒变异后引起的猪场感染

      

    1921年非洲猪瘟在肯尼亚第一次报道,家猪的死亡率为100%(Montgomery,1921)。2010年从不同地区和宿主(家猪、疣猪、扁虱)上分离得到的11株非洲和欧洲ASFV分离株,毒力大小各不相同,在基因组水平也呈现显著的遗传差异(De Villlier等,2010)。我国养猪过程中疫苗免疫种类多大剂量,猪体内抗体种类多,存在其他疫病抗体与ASFV交叉反应,以及干扰素等非特异性免疫应答的可能性,这可能导致ASFV感染猪病程增长,甚至产生抗体。若ASF在国内出现大规模流行,也可能出现病毒驯化的情况。较qPCR的抗原检测,ELISA抗体检测能够帮助猪场及时发现非洲猪瘟病毒变异后的感染。

     

    4、及时发现隐性带毒动物

     

    家猪和野猪都是ASFV等天然宿主,其中有三种非洲野猪可以隐性带毒,成为病毒储存器,这三种野猪是疣猪(Phacochoerus aethiopicus)、大林猪(Hylochoerus meinertzhageni)和非洲野猪(Potamochoerus porcus)(De Tray,1957)。我国除了野猪,还有众多的地方猪品种,很有可能存在众多对来势汹汹的ASFV不当回事,隐性带毒的动物存在。这一问题如果不能及时发现,后患无穷。

    综上所述,我认为ASFV抗体检测的意义在于抗体阳性结果具有明确的诊断意义,抗体阴性结果不能说明任何问题,需正确看待。抗体检测在当前会为我们揭示更全面的ASF疫情,在ASF根除过程中帮助我们及时发现疫情的变化。

    目前进口的商品化ELISA抗体检测试剂盒并不多,以下品牌的ELISA试剂盒都经欧盟非洲猪瘟参考实验室(同时也是OIE和FAO非洲猪瘟参考实验室)西班牙CISA-INIA实验室验证,可以查询对应的验证结果,可网上自行查询选择。

    制造商

    技术类型

    包被抗原

    立陶宛

    LT Biotech

    间接ELISA

    p22

    法国 IDVET

    间接ELISA

    重组蛋白

    瑞典

    SVANOVA

    间接ELISA

    p30

    西班牙

    INGENASA

    阻断ELISA

    p72

    CISA-INIA指出,在ASF呈地方流行的区域,确诊可疑病例最好用标准的血清学试验(ELISA),结合另一种血清学试验(IFA)或抗原检测试验(FAT)。在有些国家,95%以上的阳性病例用IFA和FAT结合方法鉴定。IFA和FAT技术目前在国内兽医实验室普及度很低,建议多结合qPCR核酸检测结果诊断。(资料来源:兽医兽诊断试剂) 

     

    以上就是100唯尔教育网(100vr.com)小编为您介绍的关于非洲猪瘟的知识技巧了,学习以上的农林牧渔-兽医学:非洲猪瘟的实验室诊断技术知识,对于非洲猪瘟的帮助都是非常大的,这也是新手学习农林牧渔所需要注意的地方。如果使用100唯尔教育还有什么问题可以点击右侧人工服务,我们会有专业的人士来为您解答。

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    【职教新闻】 2021-10-14

    山东省教育厅最新通知,将建设100所左右这类学校

    山东省教育厅发布《关于实施山东省高水平中等职业学校建设计划的通知》,集中力量建设100所左右高水平中等职业学校。 该项目目标为,建设周期结束后,学校办学水平和人才培养质量显著提高,技术创新服务能力显著增强,对经济社会发展的贡献度显著提升,一批学校达到国内一流、世界水平。 建设一批高水平中等职业学校,促进我省中等职业教育高质量发展,更好服务区域经济社会。 《计划》包含10项建设内容,其中,要强化专业(群)建设,面向区域或行业重点产业,建设1—2个高水平特色化专业(群),以“信息技术+”升级传统专业,发展数字经济催生的新兴专业。打造高水平教学创新团队,建成在全省开放共享的专业(群)精品课程、教学资源库和实践教学基地,建立创新型、发展型、复合型技术技能人才培养体系。 在深化教学改革中,创新德技并修、工学结合、“岗课赛证”融合育人机制,实行校企联合培养、“双主体”育人的中国特色现代学徒制,深入推行“1+X”证书制度。深化教材改革,积极使用新型活页式、工作手册式教材并配套开发信息化资源。建立基于能力标准的学习成果认定办法,完善以学习者为中心的教学评价体系,提高人才培养质量。 在师资队伍建设上,落实教师自主招聘及20%编制员额自主聘用专业兼职教师政策,引进具有创新实践经验的技术能手、产业导师到学校任教。制定教师专业发展规划,搭建教师专业成长平台。深化内部管理改革,创新教师评价机制,全面落实教师绩效工资政策,清理唯论文、唯帽子、唯职称、唯学历、唯奖项倾向的政策规定,建立以业绩贡献和能力水平为导向、以目标管理和目标考核为重点的绩效工资动态调整机制,实现多劳多得、优绩优酬。 深化产教融合、校企合作,深化与区域行业、企业在人才培养、技术创新、就业创业、社会服务、文化传承等方面合作,形成校企命运共同体。校企共建公共实训平台、技能技艺传承平台、技能大师工作室等技术技能积累与创新载体,提高协同育人能力。牵头或参与组建职业教育集团,探索各相关方以产业链、资产链、人才链等为纽带实施实体化运作。建立校企共同参与的质量评价机制。 加快智慧校园建设,以信息化学习环境和优质数字教育资源建设为基础,以教育教学模式和学习方式为核心,推进信息技术与教育教学的深度融合。对接企业生产服务智能化流程,加强数字化技能教室、虚拟仿真实训室、校园安防系统、物联网等智慧教育硬件基础建设。适应“互联网+职业教育”需求,开发优质专业教学资源库、网络课程、模拟仿真实训软件和生产实际教学案例。提升师生信息素养,应用信息技术改造传统教学,广泛开展线上线下混合教学,促进自主、泛在、个性化学习。 积极参与职业教育国际(地区)交流与合作,原则上每所学校至少有一所稳定的国(境)外合作学校。引进职业教育发达国家的优质教育资源,对接国际标准开发专业教学标准和课程体系,鼓励高水平专业的课程与发达国家互通互认。加强教师出国(境)培训,具有国(境)外研修培训经历的教师达5%以上。服务“一带一路”倡议,提高职业教育资源和技术技能人才输出能力。 还要提升服务能力和水平,充分发挥学校师资、设备和技术等资源优势,建设社区学院,开展社区教育和终身学习服务;面向农业农村,开展职业教育和培训;积极开展面向未升学初高中毕业生、退役军人、农民工、建档立卡贫困劳动力、残疾人等重点人群的就业创业培训,大力开展失业人员再就业培训,年培训人次数达到在校生数的2倍以上;面向中小企业开展技术咨询、技术服务等。 《计划》规定申报学校为独立设置的中等职业学校,办学条件高于中等职业学校设置标准。 申报学校为已通过验收的国家中等职业教育改革发展示范校,或立项建设的省示范性及优质特色中等职业学校,或已通过验收(认定)的省规范化中等职业学校。 申报2021年首批高水平中等职业学校须是已通过验收的国家中等职业教育改革发展示范校,或立项建设的省示范性及优质特色中等职业学校。 学校还要在以下9项标志性成果中有不少于6项成果。 1.获得近两届省级及以上职业教育教学成果奖(第一完成单位),或获得省级及以上教材建设奖(主编所在单位)。 2.承担省级及以上职业教育教学改革试点且成效明显(仅包括教学工作诊断与改进、现代学徒制、“1+X”证书制度试点)。 3.有立项的山东省中等职业教育品牌专业建设项目。 4.承担山东省职业教育教学改革研究项目(仅包含一般、重点项目立项,且为第一主持单位)。 5.近五年承办过省级及以上职业院校技能大赛,或近五年学生在国家级以上竞赛中获得过奖励(仅包括全国职业院校技能大赛、中国职业技能大赛、世界技能大赛)。 6.近五年教师获得过省级及以上奖励(仅包括职业院校教师教学能力大赛、中职班主任能力比赛,国家“万人计划”教学名师,全国、全省教书育人楷模,省级及以上名师工作室,省级及以上教学团队,齐鲁名师、齐鲁名校长,省青年技能名师)。 7.承担省级及以上精品资源共享课程建设项目,或牵头成立省级及以上职业教育集团(联盟),或省级以上政府部门设立的综合性公共实训基地,或行业头部企业设立的在职员工培训基地。 8.牵头制定省级及以上中等职业学校专业教学标准(教学指导方案)或公共基础课课程标准,或有主编教材入选“十三五”国家规划教材。 9.办学质量和学生就业质量高,学生、家长、社会和用人单位满意度高;建立校级质量年报制度,近五年连续发布《中等职业学校质量年度报告》,且未有负面行为被通报。

    【职教新闻】 2021-10-14

    中办 国办印发《关于推动现代职业教育高质量发展的意见》

    据中央广播电视总台中国之声《新闻和报纸摘要》报道,中共中央办公厅、国务院办公厅近日印发了《关于推动现代职业教育高质量发展的意见》(以下简称《意见》)。 《意见》提出,职业教育是国民教育体系和人力资源开发的重要组成部分,肩负着培养多样化人才、传承技术技能、促进就业创业的重要职责。在全面建设社会主义现代化国家新征程中,职业教育前途广阔、大有可为。 要坚持党的领导,坚持正确办学方向,坚持立德树人,优化类型定位,深入推进育人方式、办学模式、管理体制、保障机制改革,切实增强职业教育适应性,加快构建现代职业教育体系,建设技能型社会,弘扬工匠精神,培养更多高素质技术技能人才、能工巧匠、大国工匠,为全面建设社会主义现代化国家提供有力人才和技能支撑。 主要目标是,到2025年,职业教育类型特色更加鲜明,现代职业教育体系基本建成,技能型社会建设全面推进。办学格局更加优化,办学条件大幅改善,职业本科教育招生规模不低于高等职业教育招生规模的10%,职业教育吸引力和培养质量显著提高。 到2035年,职业教育整体水平进入世界前列,技能型社会基本建成。技术技能人才社会地位大幅提升,职业教育供给与经济社会发展需求高度匹配,在全面建设社会主义现代化国家中的作用显著增强。

    【职教新闻】 2021-10-14
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